克隆怎样表达，克隆感受态和表达感受态的区别？

克隆感受态和表达感受态的区别？

      一、原理不同

      1、克隆感受态：采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。

      2、表达感受态：在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。

      二、要求不同

      1、克隆感受态：能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力；容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好；容易从宿主细胞中分离纯化出来，这才便于重组操作。

      2、表达感受态：常用细菌质粒进行构建，构建过程中运用限制性核酸内切酶切割出与目的基因相合的末端（多为黏性末端，也有平末端），采用DNA连接酶连接，导入生物体实现表达。

      三、组成部分不同

      1、克隆感受态：病毒、质粒或高等生物细胞。

      2、表达感受态：目的基因、启动子、终止子、标记基因。

怎样高表达某种基因？

      高表达某种基因的难度在哪？解决方法是什么？

【RNA干扰_shRNA克隆服务】怎样利用shRNA敲低基因表达？

      生物体中普遍存在RNAi机制，若要人为地引起基因表达沉默，把针对靶mRNA设计的siRNA导入细胞和把相应的shRNA导入细胞，理论上来说效果是一样的。相比siRNA导入，利用shRNA载体导入能够实现长期稳定表达。那么，怎样利用shRNA实现目的基因的敲低呢？

      基于载体的shRNAs（Vector-basedshRNAs），多数由聚合酶III型启动子驱动表达。常见的聚合酶III型启动子包括U6和H1，这类启动子缺少组织特异性，主要用来启动比较短的RNA，且末端需要4-6个连续的T来终止转录。

      关于Vector-basedshRNAs，为了满足广大科研工作者不同的实验需求，维真生物可以提供多种shRNA质粒构建服务：

      客户提供高效siRNA靶点，我们根据靶点构建shRNA质粒。

      根据客户提供的靶基因信息构建3保1或者4保1shRNA质粒。

      根据客户提供的高效siRNA靶点和靶基因信息构建多和1shRNA质粒。

      以4in1shRNA为例：该服务是将4条shRNA序列克隆至1个shRNA质粒。维真生物的4in1shRNA质粒不仅可以用于转染细胞，也可包装成病毒用于病毒导入宿主。

      优势

      1）将4个作用于同一基因不同mRNA部位的shRNA序列克隆进同一shRNA载体，增加了目的基因下调表达的概率。

      2）将高效的、作用于2-4个靶基因的shRNA序列克隆进同一shRNA载体，实现2-4个基因同时下调表达的目的。

      3）无需序列筛选，大大减少实验工作量。

      4）多种4in1shRNA病毒载体的选择，包括腺病毒穿梭载体、慢病毒载体和腺相关病毒载体，实现不同的实验目的。

      shRNA的RNAi机制与microRNA成熟机制一样，因此，shRNA也可以由聚合酶II型启动子驱动表达。这类启动子包括广谱启动子(如CMV、CAG和EF1a等)和组织特异性启动子(如hSyn、TBG和cTnT等)，可以启动较大的基因转录，且需要polyA等转录终止信号。维真生物可以根据客户指定的启动子和提供的shRNA序列将其构建至mir30-basedshRNA质粒。mir30-basedshRNA结构示意图如下：

      以CreonshRNA为例，该服务是使用FLEX(flip-excision)系统实现shRNA诱导表达。FLEX是一种非常强大的控制基因表达的方法，它采用2对异质、反向的loxp位点(loxP和lox2272)，经过DNA翻转产生带有不同loxp位点的DNA翻转，防止进一步的DNA翻转，实现目标基因不可逆的翻转。维真生物采用改良版FLEX，将2对异质、反向的loxp位点置于启动子两边，通过cre作用决定启动子方向，通过不同荧光蛋白可视化shRNA的表达。

原克隆表达的研究内容方法？

      基因的表达和调控是植物基因工程研究的中心内容之一,从基因克隆方法、克隆栽体的构建、瞬时表达分析、报告基因的选择以及基因表达量分析的方法5个方面对植物基因克隆与表达的研究进展进行了综述.

怎样高表达某种基因？

      说明1:评论里有说我直接把文章粘过来了。这确实是答主之前的一篇文章，原文在此微生物内进行蛋白质表达前需要考虑的8件事|BioEngX说实话，我认为一篇文章根本解释不清楚这个问题，写一本书可能合适。所以在文后又附上了一篇文章，解释为了获得高表达的基因，怎样选择表达系统。

      说明2:评论里说你的文章水平一般啊。额，这就没办法了，知识有限，理解不深，请见谅了。

      以下为原答案。

      题目虽然短短几个字，但回答起来却不那么容易。只从其中的一个小角度，给出一点思考---微生物内进行蛋白质的表达，应该考虑哪些事情。

      在微生物内进行蛋白质表达是生物科技中的核心技术。然而，每种蛋白质都具有其独特的结构性质，比如二硫键（disulfidebonds）数量，是否存在疏水区域(hydrophobicregions)，是否存在跨膜区域(transmembranedomains)，是否具有糖基化(glycosylations)等翻译后修饰过程等，所有的这些性质都可能决定着蛋白质表达过程的难易。在与目的蛋白质来源相似的宿主内表达蛋白质要相对容易些。然而，大多时候，我们需要在与蛋白质来源不同的宿主内进行蛋白质的表达，比如在原核细胞内表达真核生物的蛋白质，这通常是具有挑战性的。在这里，与大家分享几个有助于跨系统实现蛋白质表达的工具。

      1、密码子优化

      为了理解密码子优化(codonoptimization)的重要性，我们需要首先知道什么是密码子优化。简单来讲，就是在我们构建的载体内引入宿主系统tRNA更愿意读取的密码子，这样能够更容易将其翻译成氨基酸，这会提高翻译速度，提高蛋白质表达的效率。没错，我这里用了“更愿意”这样一个主观性很强的词。实际中确实是这样的，生物系统是具有密码子偏好性的，不论真核生物还是原核生物，每种生物都会表现出某种程度的密码子利用的差异和偏爱。这是因为不同生物系统对于特定的密码子具有不同数量的可利用的tRNAs，并且每一个系统内对于每一个密码子，都有特定数量的tRNAs。所以，如果tRNAs与密码子数量的比例不正确，就会阻碍蛋白质的表达。因此，在进行蛋白质表达前，需要根据表达系统，对目的基因进行密码子优化，使用宿主系统内存在的tRNAs更偏好的密码子。

      2、纯化标签

      当我们在微生物内进行蛋白质的表达时，最后通常都是要对蛋白质进行纯化的。当然，如果你只是为了应用全细胞提取物或者裂解提取物，可以不用考虑蛋白质的纯化问题。为了实现蛋白质的纯化，我们必须为蛋白质加上纯化标签。目前很多纯化标签已经被系统研究并应用于实践了，常用的纯化标签包括Histag，Strep-IItag，GST，Flat-Tag等。

      3、分子伴侣与折叠酶

      表达一个困难的基因就像砸碎一个硬坚果，有时候你需要借助外力。为了获得一个有用的蛋白，很重要的一点就是保证蛋白质正确折叠。细胞质（cytoplasm）的环境是还原性(reducing)的，这不利于二硫键的正确形成，因此会影响蛋白质的折叠。为了辅助蛋白质正确的折叠，防止形成不可溶的包涵体，我们需要表达分子伴侣(chaperones)和折叠酶(foldases)的辅助载体。一些常见的分子伴侣和折叠酶包括DsbA/C,Skp,FkpA,GroEL/ES,DnaK/J/GrpE等。我们可以根据蛋白质的表达位置，选择细胞质（cytoplasmic）内分子伴侣或者细胞间质（periplasmic）分子伴侣。另外一些标签也能够辅助蛋白质的折叠，比如麦芽糖结合蛋白（maltosebindingprotein,MBP）。MBP是一个42.5KDa的蛋白质，能够与目的蛋白质融合表达，不仅能够增加蛋白质的可溶性，还能够辅助蛋白质折叠。MBP的另一个优势是能够与交联淀粉柱（amylosecolumn）结合实现目标蛋白的纯化。

      4、蛋白质表达位置 在实验之前，我们需要考虑蛋白质在哪里表达，是细胞质内（cytoplasm），细胞间质（periplasm）还是细胞外(extracellular)分泌表达。如果一个蛋白质内包含有二硫键，我们最好在细胞间质的氧化环境内令其表达。氧化环境能够帮助蛋白质形成正确的二硫键从而获得正确的结构。如果想要蛋白质在细胞内特定的位置表达或分泌到细胞外，需在蛋白质的N端添加信号肽（signalsequence）。在信号肽的帮助下，蛋白质能够转移到特定的位置。例如，来自果胶杆菌（Pectobacteriumcarotovorum）内的PelB信号肽能够引导蛋白质进入到革兰氏阴性菌（gram-negative）的细胞间质中。再比如，来自变铅青链霉菌（Streptomyceslividans）内的信号肽能够将使蛋白质分泌表达到培养基之中。

      5、蛋白质表达通路

      蛋白质分泌表达具有很多的优势。一方面分泌表达蛋白质能够减少对宿主菌的毒性和代谢负担，使菌适应性增加；另一方面周质空间和胞外培养基中宿主菌蛋白含量很低，有利于目的蛋白的纯化。不同的表达途径对蛋白质的折叠效率有很大的影响。革兰氏阴性菌共分为5种天然分泌系统，即I型，II型，III型，IV型和V型。E.coli主要通过I型和II型系统分泌表达蛋白质。Ⅰ型分泌系统通过α-溶血素途径直接介导胞外分泌，组成元件简单，外源重组蛋白与HlyAC-端结合后，再与HlyB/HlyD形成复合物，由ATP水解提供能量，通过TolC通路实现胞外分泌。通过该系统分泌出胞外的蛋白C端仍然带有一段信号序列，需要在体外进行剪切;此外该系统中的一些共表达部件对目的蛋白的转运有竞争作用，重组蛋白表达量很低。Ⅱ型分泌系统先介导细胞周质分泌，再经过MTB(mainterminalbranch)机制实现胞外分泌。分泌蛋白利用以下三种途径透过细胞质膜:Sec(secretion)通路、信号识别颗粒(signalrecognitionparticle,SRP)通路或双精氨酸转移(twinargininetranslocation,TAT)通路。三种通路有所不同，Sec通路将蛋白质转移到周质空间后蛋白质进行折叠，TAT通路却是将折叠后的蛋白质转移到细胞周质，而SRP途径允许蛋白质同时进行折叠与转移的过程[1]。由于Ecoli跨越内膜的转运装置不完善，蛋白输出能力不够,蛋白酶降解等原因导致分泌效率低，胞外分泌量往往达不到实验或工业生产的要求，目前大肠杆菌的分泌主要是指重组蛋白通过Ⅰ或Ⅱ型系统透过胞质膜分泌至周质腔[2]。

      6、表达菌株

      不同的大肠杆菌菌株在培养条件和外源基因表达能力上存在着很大差别，因此不同宿主菌的选择对表达产物的积累以及下游分离纯化有至关重要的作用。利用蛋白酶表达缺陷的突变菌株可以提高重组蛋白的分泌表达量,一些缺陷性菌株(如合成外膜元件的基因突变体)既能够产生可溶性的、具有正确空间结构和二硫键的活性蛋白，又能够避免细胞壁在外源蛋白跨膜转运中的阻碍作用，有利于重组蛋白分泌到培养基中。最成功的例子就是L2型细菌(缺乏细胞壁和胞周质)已用于青霉素酰基转移酶、链激酶、微小抗体的分泌表达中。但因为这些菌株有生长受损性，不能耐受高密度发酵的过程，L2型细菌不适合工业化生产。总之有很多种类的菌株可以用来实现蛋白质的表达。有关大肠杆菌的菌株及表达载体，大家可以从这个网站了解到，http://Ecoliwiki.net。

      7、培养基，温度，诱导条件等因素 培养基成分、培养方式、培养条件及培养过程中抑制性代谢产物的积累等都会影响重组蛋白在工程菌中的表达产量和分泌的量。其中培养基营养成分、pH和温度等参数是影响工程菌生长和表达外源蛋白的重要因素,能够影响蛋白酶的活性、分泌和表达水平。向培养基中添加甘氨酸可以在不导致菌体自溶的情况下促进蛋白从周质空间向胞外的分泌,且不引起明显的细菌裂解。在培养基中添加糖胶和TritonX-100能阻止周间腔中包涵体的形成，并提高胞外表达的效率。改变培养基的渗透压、短时间的热冲击诱导及降低诱导时的温度,会明显提高重组蛋白在大肠杆菌的可溶性表达。另外，对于需要IPTG诱导的菌株，诱导时刻，温度及培养时间必须经过优化。

      8、细胞培养时间

      合适的细胞培养时间是决定着细胞完整度及蛋白质表达水平的一个重要因素。细胞培养时间过长会导致细胞裂解，目的蛋白丢失，有毒蛋白酶释放。而细胞培养时间太短的直接后果就是细胞浓度不够，目标蛋白产率太低。因此重组菌株的培养时间必须经过优化。

      Reference:

      【1】ValentQA,ScottiPAandetal.TheEscherichiacoliSRPandSecBtargetingpathwaysconvergeatthetranslocon.EMBOJ.1998May1;17(9):2504-12.

      【2】郑海洲,刘晓志,宋欣.重组蛋白在大肠杆菌分泌表达的研究进展.天津药学杂志,2009,21（4）：0040-42.

      下面的文字，专门解释表达蛋白应该选择什么系统。

      当你决定克隆或者表达某个蛋白质时，你需要考虑使用哪些表达系统。

      目前有以下一些可以适用于大规模生产蛋白的表达系统:

      大肠杆菌表达系统

      用大肠杆菌进行蛋白表达是最简单、最快、最便宜的方法。现在有很多商业和非商业的表达载体可以应用，这些载体通常包含有N-和C-末端的纯化标签。另外，很多菌种已经被优化可用于特定蛋白的表达。

      酵母表达系统

      酵母菌是一类真核微生物，相比于大肠杆菌，酵母菌有一些较为突出优点。其优点之一就是，酵母菌培养能够达到一个很高的浓度，这使得酵母菌更适用于同位素标记蛋白的表达生产。最常用的两种酵母菌株是酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）和毕赤酵母（Pichiapastoris）。

      昆虫细胞表达系统

      昆虫细胞是比酵母更高级的真核生命表达系统，能够更好地进行蛋白翻译后的加工修饰。因此，当你想要表达某种哺乳动物的蛋白时，使用昆虫细胞作为表达系统，能够使你有更大的机会去获得可溶性蛋白。使用昆虫细胞表达蛋白的不足之处在于成本较高，而且还需要很长的时间才能得到你的蛋白（通常两周）。

      哺乳动物表达系统

      很多实验室将HEK(人胚肾)细胞系和CHO(中国仓鼠卵巢)细胞系，用于表达制备更加复杂的、需要适当翻译后修饰的蛋白。这两个细胞系既可以用于瞬时表达也可以用于稳定系表达。稳定的细胞系表达需要消耗一定的时间，但也具有更高的生产率以及更少的变异。另外，这些细胞对分泌蛋白具有高表达能力(商业蛋白高达10或100毫克每升，甚至往往几克每升)，但胞内蛋白的表达水平通常都比较低。

      怎样判断哪种表达系统更利于自己的研究呢？你需要问自己这几个问题:

      1.想要表达什么类型的蛋白?

      当你想要表达的是一个原核蛋白时，很明显应该选择大肠杆菌。这个方法迅速价廉，同时大肠杆菌具有针对原核蛋白的所有折叠和翻译后修饰功能。如果是真核蛋白的话，表达方法的选择就取决于更多的因素了（见下文）。

      2.用大肠杆菌表达时能得到可溶性蛋白吗?

      鉴于前面提到的种种原因，真核蛋白的表达通常也将大肠杆菌作为首选表达方法。然而，许多真核蛋白在大肠杆菌内表达时不能进行适当的折叠，从而会形成不可溶的聚集体（也称包涵体）。当然有时候，将包涵体溶解，或是通过低温表达蛋白来提高溶解度是有可能实现的。另外，恰当的使用分子伴侣如谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase，GST)，麦芽糖结合蛋白(MBP)等也可以提高目的蛋白的溶解性。然而与其尝试10种不同的大肠杆菌，不如换用真核表达系统。

      3.表达的蛋白需要翻译后修饰吗？

      许多蛋白为了获得相应的活性或是正确的结构，需要在翻译后进行修饰。最简单的一种修饰是发生在所有的生物体中的去除N-末端的蛋氨酸残基。更复杂的修饰，如N/O–糖基化，N/O–磷酸化则只发生在部分真核细胞中。

      4.表达的蛋白用到哪些密码子?

      我们知道，在生命体中61个密码子的使用频率是不一样的。有些密码子非常重要，是由于它们出现在高水平表达基因中，而一些低频密码子则出现在低表达水平的基因中。对于不同的生命体，低频密码子也不尽相同，这取决于生命体本身。不同系统使用密码子情况可以在condonusagedatabase中获知（http://www.kazusa.or.jp/codon/）。往往，密码子的使用频率反应了同源tRNA的数量水平。因此，当你的目的蛋白的密码子用法与宿主的密码子用法不同时，有可能在表达蛋白时会出现问题。下面这些问题经常发生:

      要想提高大肠杆菌中含有低频密码子蛋白的表达水平，有以下两个方法:

      •定点突变。在具有相同的残基情况下，用高频密码子去替换低频密码子。如，大肠杆菌中的精氨酸低频密码子AGA,AGG可以用高频密码子CGC替换。 •与编码稀有tRNA的基因共表达。下面的表格提供了几个可以用于编码多个稀有tRNA的大肠杆菌菌株

      利用这些菌株进行基因表达时，你经常会得到完整蛋白和被截断的片段蛋白的混合物。利用C-末端纯化标记（比如Histag），可以采用亲和层析的方法纯化到完整蛋白。当用上面两种方法来提高蛋白质的表达水平都失败的情况下，就需要考虑改用其他表达系统如酵母菌和昆虫细胞等。如果目的蛋白包含了很多大肠杆菌的低频密码子，最好直接采用真核表达系统。最后我们通过一张表系统的了解不同表达系统的特点。

      References

      ProteinExpression.Apracticalapproach(Higgins.S.J.&Hames,B.D.,eds),OxfordUniversityPress,1999. Kane,J.F.(1995)Effectsofrarecodonclustersonhigh-levelexpressionofheterologousproteinsinEscherichiacoli.CurrentOpinionsBiotechnol.6,494-500.

      Zhang,S.,Zubay,G.&Goldman,E.(1991)Low-usagecodonsinEscherichiacoli,yeast,fruitflyandprimates.Gene105,61-72. CalderoneTL,StevensRD,OasTG.High-levelMisincorporationofLysineforArginineatAGACodonsinaFusionProteinExpressedinEscherichiacoli[J].Journalofmolecularbiology,1996,262(4):407-412.

      Novy,R.,Drott,D.,Yaeger,K.&Mierenhof,R.(2001)OvercomingthecodonbiasofE.coliforenhancedproteinexpression.inNovations12,1-3.

      上文的原文链接在这里表达蛋白，你用什么系统？|BioEngX