【已回答】高效液相色谱装流动相的瓶子近一年没用,脏,请问怎么处理,买硝酸泡吗,要多少浓度的、用什么容器?

流动相过滤装置怎么用

高效液相色谱装流动相的瓶子近一年没用,脏,请问怎么处理,买硝酸泡吗,要多少浓度的、用什么容器?

      刷洗干净,烘干,铬酸洗液浸泡一天,洗净,烘干。

高效液相色谱装流动相的瓶子近一年没用,脏,请问怎么处理,买硝酸泡吗,要多少浓度的、用什么容器?

      追溯液相色谱的发展历史,最早最经典的液相色谱实验当属俄国植物学家茨维特的叶绿色提取实验:将植物色素提取液从一根装有碳酸钙吸附剂的玻璃管顶端加入,然后用纯石油醚进行淋洗,随着石油醚往下流动,不同色素逐渐分开形成色带。液相色谱技术发展到今天,商业化的色谱仪已广泛用于分析混合物,但无论仪器设备怎样发展,现代色谱仪的组成仍源于茨维特实验。液相色谱仪主要包括储液瓶、泵、进样器、色谱柱、检测器、数据处理系统(图1)本专题将按色谱仪的基本组成,简要介绍各部分的工作原理及注意事项。

图1.液相色谱结构图

1.储液瓶

      储液瓶用于盛放流动相(图2),规格有25ml、500ml、1000ml、2000ml甚至更大。储液瓶通常为高硼硅玻璃材质,也有特殊情况,比如离子色谱使用聚氯乙烯储液瓶以避免引入金属离子干扰。存储特殊的流动相时,储液瓶的颜色也会不同。比如水相,常用棕色瓶进行避光,以降低细菌生长速度。

      开孔储液瓶瓶盖是与储液瓶配套使用的,流动相传输管穿过瓶盖上的孔插入储液瓶内。瓶盖主要包括三部分:聚丙烯外壳、硅胶防漏垫圈和四氟乙烯白色内盖,该类材质需具有良好的抗腐蚀、耐高温性能。瓶盖有单孔、双孔、三孔等规格,用于插入不同数目的管路(图2b),管路与孔之间存在一定间隙或有多余的孔用于排气,以防止瓶内负压过低,导致流动相不能顺畅输出到泵体。

图2.流动相储液瓶

      洁净度是储液瓶最基本也是最重要的标准。不干净的储液瓶会引入杂质,干扰分析结果,甚至将导致后续流动相管路堵塞,诱导泵体故障。因此,储液瓶需要定期按标准玻璃器皿清洗流程进行清洗,以确保流动相质量。主要过程如下:(1)浸酸:将储液瓶浸泡于重铬酸钾、浓硫酸、蒸馏水的清洁液中,时间不少于4小时。清洁液具有很强的氧化作用、去污能力强,能有效去除微生物和微量杂质;(2)冲洗:先用自来水充分冲洗,火吸管等冲洗10分钟,瓶内灌满、倒掉,反复20次以上;再用去离子水冲洗,不留死角,瓶内灌满、倒掉,反复10次以上,然后用超纯水进行充分漂洗和润洗,最后晾干或烘干备用。清洗液配比如下表:

      表1.不同酸度的重铬酸钾清洗液配比

      注意事项:清洗液使用耐酸抗氧化性塑料容器存储;将重铬酸钾倒入水中,搅拌溶解,然后缓慢加入浓硫酸,由于浓硫酸密度大,且遇水放出大量热,操作切勿过急,严禁将重铬酸钾溶液倒入浓硫酸中。

      上述清洗方法,需进行充分的冲洗和润洗,否则可能会引入较多杂质。笔者所在的色质谱实验室,流动相更换频率较高,在储液瓶中盛满有机相和超纯水的混合溶液(比如10%-20%有机相),超声半小时再进行超纯水清洗,可达到简单清洗的目的。储液瓶除定期清洗外,平时操作应养成良好习惯,比如:勤换水相;更换流动相,先润洗再更新,禁止在剩余流动相中直接添加新的流动相;瓶盖上多余不用的孔,可用堵头堵紧或用铝箔封住储液瓶口,防止灰尘落入。但是原则上不建议使用封口膜封住储液瓶口,因为流动相可能会溶出封口膜中的聚合物成分产生杂质。

2.过滤沉子

      过滤沉子位于流动相管路末端(图2a),在重力作用下使流动相管路没入储液瓶底部。沉子是表面具有1μm、2μm、5μm、10μm、20μm等各种孔径规格的吸滤头,常用规格为2μm和10μm,能有效防止已经进入储液瓶内的灰尘进入后续液相系统。储液瓶一般高于泵体50cm以上,基于虹吸作用,流动相能快速经过沉子。市场上基本的沉子有不锈钢、陶瓷、Peek等其他惰性材质(图2c)。

      过滤沉子也需定期进行超声清洗。用于反相色谱的沉子,先用超纯水加热超声15分钟以除去沉子上的盐分,再用HPLC级的异丙醇超声15分钟除去有机物,最后用HPLC级甲醇超声15分钟除去难溶物。用于正相色谱的沉子,超声使用的溶剂依次为乙醇-超纯水-异丙醇-乙醇,超声时间为15分钟左右。

3.流动相

      流动相是影响色谱分离的关键因素之一,高纯度、无微粒的流动相是液相色谱分析最重要的标准之一。满足这一标准,最简单的方式是尽可能使用高质量的溶剂,高效液相色谱纯(HPLC)级别是液相色谱的基本要求,对于液质联用仪器,由于质谱具有很高的灵敏度,要求使用质谱纯(LC-MS)级别的溶剂。

      3.1配制液相流动相可分有机相和水相,为保证流动相配比的准确性和质量,配制流动相时需注意以下事项:

流动相配置过程中使用的量筒等玻璃器皿需预先清洗干净,有机相和水相使用的量筒最好分开使用;尽可能使用HPLC或LC-MS纯度试剂,如加入甲酸、乙酸或氨水类添加剂,也尽量使用高纯试剂,盖上盖子摇匀;含缓冲盐的流动相,需准确称量缓冲盐,并置于容量瓶中溶解;对pH有要求的流动相,加入酸、碱进行pH值调节,并测量pH值;流动相需经过滤和脱气处理;配制好的流动相,需注明流动相成分及配制日期。

      3.2过滤进口商业化的HPLC试剂在分瓶之前已经过滤膜过滤(一般为0.22μm),Milli-Q超纯水在纯化过程的最后一步,也会经过0.22μm滤膜。此类HPLC纯度的溶剂可以直接使用,无需再进行过滤。如果在上述流动相中添加其他非HPLC级别的试剂或者缓冲盐,使用前强烈建议过0.22μm滤膜。

      流动相过滤装置见图3,主要包括:滤杯,滤膜,砂芯,接收瓶,真空泵。流动相盛放于滤杯中,在真空用下,经滤膜和砂芯过滤,最后被接收瓶接收。过滤装置使用的玻璃器皿或连接管要求为惰性材质,避免引入更多杂质。滤膜常用孔径为0.22μm和0.45μm,根据流动相性质差异,滤膜又可分水相滤膜和有机相滤膜,以确保过滤过程中,滤膜成分不被流动相溶解带入更多杂质。

图3流动相过滤装置图

      3.3脱气商业化的液相色谱仪具有在线脱气功能,保证流动相进入泵前除去气泡。流动相中若含有气泡,会导致泵压增加,流动相传输不畅;对于检测器而言,气泡的存在会产生假的色谱信号,导致基线不稳;对于电化学检测器,气泡中氧气的存在,甚至导致化合物氧化、检测结果不准。因此流动相需要进行脱气处理。氦气喷雾脱气、真空脱气和在线脱气是常见的脱气方式。

      3.3.1氦气脱气氦气在流动相中溶解度小,可有效脱去流动相中的气泡。具体做法为:在流动相储液瓶中,插入一根氦气管路,没入流动相的一端连接过滤沉子,另一端连接低压力的氦气流(5psi左右),由于氦气难溶,在其逸出液面过程中将带走流动相中溶解的空气。需要提醒的是,不同体系,使用氦气脱气也稍有不同。反相色谱,使用该方法脱气数分钟可达到目标;而正相色谱,由于流动相极易挥发,需缩短脱气时间或通过其他方式脱气。常规的液相分析仪器,使用氦气脱气较少,在制备液相色谱中,由于管路粗,流动相流速大,流动相中易含有空气,氦气脱气较为普遍。色质谱实验室正反相制备色谱仪,均采用氦气补入进行脱气。

      3.3.2真空脱气流动相置于真空环境10-15分钟,可有效脱去流动相中60-70%的溶解气体。在图3中,流动相过滤结束,接收瓶用惰性橡皮塞封口,真空泵继续工作数分钟,即可实现流动相脱气。实验室中将整个流动相储液瓶放在超声波清洗仪中进行超声,也可脱气。

      3.3.3在线脱气在线脱气是最为普遍的一种脱气方式,商业化的液相设备都装有在线脱气机,位于高压混合器或者比例阀之前(图4a)。在线脱气机的工作原理如图4b所示:流动相经过聚合物管路,该管路能选择性让气泡通过,而流动相不通过,整个管路置于真空腔体中,由于压力变化,溶解在流动相中的气泡将被拉出聚合物管道。与氦气脱气相比,在线脱气效率较低,但成本较低。

图4在线脱气机原理图

hplc操作步骤?

      高效液相色谱仪操作步骤:

      1).过滤流动相,根据需要选择不同的滤膜。

      2).对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。

      3).打开HPLC工作站(包括计算机软件和色谱仪),连接好流动相管道,连接检测系统。

      4).进入HPLC控制界面主菜单,点击manual,进入手动菜单。

      5).有一段时间没用,或者换了新的流动相,需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵,直接在泵的出水口,用针头抽取。冲洗进样阀,需要在manual菜单下,先点击purge,再点击start,冲洗时速度不要超过10ml/min。

      6).调节流量,初次使用新的流动相,可以先试一下压力,流速越大,压力越大,一般不要超过2000。点击injure,选用合适的流速,点击on,走基线,观察基线的情况。

      7).设计走样方法。点击file,选取selectusersandmethods,可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法,点击newmethod。选取需要的配件,包括进样阀,泵,检测器等,根据需要而不同。选完后,点击protocol。一个完整的走样方法需要包括:a.进样前的稳流,一般2-5分钟;b.基线归零;c.进样阀的loading-inject转换;d.走样时间,随不同的样品而不同。

      8).进样和进样后操作。选定走样方法,点击start。进样,所有的样品均需过滤。方法走完后,点击postrun,可记录数据和做标记等。全部样品走完后,再用上面的方法走一段基线,洗掉剩余物。

      9).关机时,先关计算机,再关液相色谱。

      10).填写登记本,由负责人签字。

高效液相色谱的使用?

      液相色谱仪是属于易学难用的仪器,比较讲究“正确使用”和经验。液相工作者接触最多的是流动相,流动相是造成液相色谱各种问题的关键源头。液相色谱仪常见的故障一是堵,二是漏。“堵”的表现现象就是柱压异常升高,直接原因就是流路不畅。堵塞的主要位置就是在色谱柱的前端,主要原因就是流动相里有杂质,杂质的主要来源就是细菌。

安捷伦液相色谱仪1290

      注:流动相以甲醇为例,色谱柱以C18为例,液相色谱仪引起堵的原因如下:

      原因一:配制流动相时细菌污染

      首先我们要认识到,一般的国产甲醇其实不需要额外过滤处理,直接使用没有问题。即使是有些固态微粒杂质,也能在液相流路系统最前端的过滤头上排除,真正容易引起问题的,是水中的细菌。+U&&新制备的纯水在室内放置几天就会长菌,而这些细菌虽然肉眼不可见,却足以堵塞柱填料颗粒的空隙,造成柱子很快报废。这就是在配制流动相时造成的细菌污染的原因,解决它的方法很简单,就是确保水的可靠性。

      推荐两种解决方法:

        (1)理想的方式当然是购买实验室专用纯水机,既方便又可靠,质量也放心。

        (2)成箱购买市售品牌纯净水,如500ml一支的怡宝或娃哈哈,这些水的质量足以应付液相色谱的要求。先随机抽取一支做一下细菌平板实验,待菌落数合格方可使用。这样每次只要单独开一支即可,也很方便。每次成本2元左右。细节是:在绝大多数书本上,凡谈到配制流动相都会谈到后面有一个过滤的步骤。从我们长期使用的实际效果来说,只要能保证水的质量,这一步完全可以也应当去除。

      因为:

      (1)流动相过滤在理论上有好处,但是实际操作时由于不可能做到专瓶专用,反而容易造成的交叉污染,对于配比复杂的流动相影响更大。

      (2)流动相过滤在经济成本上不划算。买一套过滤装置要6000多元,且过滤器公认是比较容易损坏的设备。主要是过滤片的成本太高,一片就要几十元。按一般液相柱的正常使用寿命计算,过滤片的成本会远远高于色谱柱的成本。

      (3)流动相过滤对于工作效率成本不划算。使用溶剂过滤器有一个预清洗、装备、使用、用后清洗,晾干的过程,至少也有一个小时的时间。这个成本也不能忽视。

      (4)在实际工作未发现流动相不过滤会对柱寿命有任何影响。我们起码有6年时间没有做过流动相过滤的工作,但是和国内同行相比较,在同等使用强度下我们的柱寿命是比较长的。

      原因二:使用流动相时的细菌污染

        指的是:流动相刚开始没有长菌,在使用时却产生了细菌污染。主要是在使用多元液相色谱仪时的一种不良使用习惯造成的。

      举最简单的例子:50%的甲醇水流动相,有两种使用方式。

      一种方式是在上机前就配好混合在一起;

      另一种方式是在流路A放纯甲醇,流路B放纯水。

      从单纯实验效果来说,后一种有明显的优点:首先是简单,不需要实验者另个计算配比混合,其次就是比例准确,能得到保留时间重复性极好的实验效果。它有一个致命的缺陷就是纯水在流动相瓶中几天时间就会长细菌(很多情况下不仅仅用纯水作流动相,而是用缓冲盐溶液,本身就是优质肥料,细菌长得更迅速),一旦有细菌柱子就坏得很快。所以这种方式要求操作人员每次实验都要用新制备的纯水,更要求在每次实验后把水相换掉,换成甲醇冲洗干净,这一点在实际工作中很多人意识不强,就是意识到了但多次使用中总有一两次会遗漏,但是往往这一两次就足以产生致命的影响。因为液相色谱柱的堵塞是不可逆的。宁可牺牲小小的保留时间的重复性,也不要用纯水溶液作为流动相的一组。从实际实验效果来说,建议用10%的甲醇水代替纯水溶液(不同比例甲醇水的细菌总数实验:在5%就基本可以抑菌,在10%及以上就可以完全杀菌了),这样可以有效排除长细菌的隐患,既可作流动相,也可冲柱。

      原因三:不适当操作

        1)在更换零件时选择的型号有误,接口不是很匹配,在拧紧的时候产生变形而使得管路堵塞。

        2)样品处理液净化得不干净,长期会在六通阀和柱之间形成阻塞不畅。

        3)在使用手动六通阀时,有些人可能由于手劲小的原因,转动的不到位,于是造成流路形成了死堵,压力快速升高超过警戒值。

        4)在使用金属管路作出废液管时,应当注意最好废液瓶中先放一些水,并把废液管的出口端放在液面下。如果位于在液相上且实验使用较高浓度的缓冲盐溶液,在停机时可能在出口端结晶成块并造成堵塞。这种情况不常见,的确有发生过。

        查堵的方法:在发生“堵”的现象后,就需要找出原因,主要是什么位置发生了“堵”。注意,绝大多数情况下,整个系统只会有一个地方发生堵塞。查堵的方法是从尾向前逆向分段拆开,仔细观察压力数值,如果某一个部件(柱子除外)装上和拆下时的压力差别很大,可发展变化判断。至于柱的堵塞,可以通过换同样规格的柱的压力是否一致来判断。