流动相过滤装置怎么用

      色谱方法开发通常耗时且费力。大家常采用的方法是，用已经习惯使用的溶剂、pH条件、缓冲盐、以及常用色谱柱的组合，作为起始条件，然后对流动相的比例进行一系列的调整，直至获得比较满意的峰形与分离。但这样的工作方式，通常极为耗时，而且也并不能获得最佳分离条件。

      更为系统性的方法策略，是利用好的实验设计，并遵循以下流程，进行高效、高质量的反相色谱方法开发。这个方法开发流程包括：

      方法筛选：流动相pH、有机溶剂、以及色谱柱，作为对选择性影响最大、因而也是最重要的条件因素，首先被加以筛选。

      方法优化：对以上得到的所有结果，评估这三个因素的何种组合，获得了最佳分离效果。在这个组合条件的基础上，进行优化或微调，以获得最终想要的结果。

      方法验证：对最终的方法进行验证，检查它是否满足预期的分离效果与分析目的。

启动

      为了设计一个有效的测试方法摸索试验，尽可能多地搜集关于样品和被分析物化学特性的信息是很重要的。

      方法开发所需信息

      有无可电离基团？电离常数？

      pH值怎样影响色谱分析？

      需要或可能采用何种检测？

      被分析物是否有紫外吸收？

      λmax？

      需要多高检测水平？

      需要多大定量限？

      是否有阻碍分离或检测的基质影响？

方法使用目的

      在开发一种测试方法之前，还需要考虑，是否理解和明确了测试方法的目标和使用目的，清楚理解使用目的将有助于确定必须要满足的性能参数以及验证方法所需关键参数，例如可能需要从样品的所有组分中分离一种对象被测物的方法，或者可能需要既能从其它组分中分离对象被测物、也能使所有组分之间能够相互分离的方法，其它考虑因素可能还包括：需要多大通量？需要多大分辨率？可以接受的拖尾因子等。

      我们采用帕罗西汀有关物质分析方法开发实例来展示系统策略。

方法筛选

      1.pH的影响

      当分析物含有可电离官能团时（可电离官能团指，在不同的pH条件下可处于不同程度的电离状态，例如：伯/仲/叔胺基、羧酸基、酚酸基），pH条件将强烈影响分析物的反相保留效果，pH条件的改变也会造成最强烈的选择性改变效果。

      酸性和碱性化合物在其未电离状态下时反相保留最大，中性化合物的保留不受pH影响

      pH是怎样影响反相保留性质的?——对于可电离化合物，要获得最强的反相保留，分析物应尽可能的不带电或电离，此时分析物的极性相对较小，在反相色谱柱上的保留就更强。因此，酸性化合物应使用低pH条件，而碱性化合物更适用高pH条件。中性化合物没有任何可电离官能团，因此，不会受到pH条件影响。这些点线图，就好比滴定曲线，与分析物分子pKa值高度相关。在开发方法时，应避免在化合物分子的pKa值附近筛选pH条件，否则，pH值的微小变化都会导致保留和选择性的剧烈变化。保留曲线的“平台区”是分析方法耐用性较强的区域。

      pH的选择与色谱柱的选择——对于帕罗西汀和它的有关物质B、D、G、F，因其胺基结构在不同pH条件下电离状态不同，使用pH10条件比pH3条件能够获得更强的保留和更好的分离选择性。由于具有更高分辨率和更好的选择性，pH10是适合被测物的pH值。下一步是评估在相同pH10值下三种不同色谱柱的色谱图，以选择具有最佳分辨率的色谱柱。三种色谱柱都显示了可检测所有组分的能力，由于C18的通用性，因此选择BEHC18色谱柱来对比不同有机改性剂的选择性。

      2.色谱柱的影响

      在选择色谱柱进行分析方法开发时，应充分认识，色谱填料基质(硅胶颗粒、杂化颗粒、聚合物颗粒)因其化学性质不同而会提供不同的保留与选择效果。

不同的键合相，不同的选择性

      在传统的HPLC系统上，随着可变的pH值和有机溶剂的组合，筛选一系列的色谱柱，会花费大量的时间。使用ACQUITYUPLC色谱柱管理器、高分辨的亚2μm短柱，配合ACQUITYUPLC系统，将大大缩短这个过程，从以往的数天时间减少到数小时。

      3.有机溶剂的影响

      甲醇和乙腈，是用于反相分离的典型有机溶剂。除了洗脱强度、粘度(与柱背压有关)、紫外吸收性不同，甲醇与乙腈在化学选择性上也有所不同，甲醇可以发生氢键作用，因此会提供显著不同的选择性。

      洗脱能力较弱

      质子化溶剂，提供氢键作用

      非质子化溶剂

      洗脱能力较强

      粘度较低(柱背压更低)

      有机溶剂相对洗脱强度曲线：

      溶剂的选择——实验图谱表明，与乙腈相比，甲醇的洗脱能力较弱，因此所有分析物都获得了更强的保留。但是，对于这个应用，乙腈提供了更好的分离选择性。因此，pH10、色谱柱BEHC18和乙腈的条件组合，就可以用作下一步的优化微调。

方法优化

      有几个参数可以用来调整或优化色谱分离效果。梯度斜率是一个用来操作以控制保留和选择性的物理参数。但是，梯度斜率经常在分离度和灵敏度之间做平衡考量。另外一个可以优化的参数是温度。每个化学过程都受温度影响，温度可以提供明显的不同选择性。

      色谱方法开发：当有关物质浓度降低时，有关物质B和D与主峰帕罗西汀的分离度明显减少。这是由于组分与帕罗西汀峰的不同浓度水平造成。这时需要进一步的优化。

方法优化与梯度斜率

      降低梯度斜率将降低灵敏度

      增加梯度斜率将增加灵敏度

方法优化与温度

      如果流速保持常数

      更高的优化线速度

      温度会影响中间的每一个化学过程，例如增加温度会降低移动相的粘度，如果流动速度恒定将导致系统背压降低，高温将改变固定相和流动相之间的分配速率，然而由于提高了被测物分散性，会加快优化线性速度。对温度变化敏感的化合物，温度的微小变化都会导致选择性发生独特变化。

      色谱分析方法优化：此例子中，温度以15℃的步幅从30℃开始上升到40℃和60℃，随着色谱柱温度增加，组分的分离性能改善，另外被测物的分散性提高，谱峰更尖锐，色谱柱温度为60℃时分离效果最佳。

方法验证提示

      方法验证用于确认分析方法的特性能否满足应用要求，验证过程中需要评估的典型色谱法特性是专属性、线性、范围、检测限、定量限、准确度、精度、稳定性。

分析方法验证

      分析方法验证经常是由多个步骤组成的反复人工过程，需要进行大量的色谱测试，以充分评估所有八种特性，审视、计算和管理这些过程获得的所有数据可能具有一定的难度。Empower方法验证管理器采用自动化的验证过程，使数据审视更加顺畅，极大提高了验证过程的效率和可靠性。

结论

      通过使用包括摸索试验和验证的方法可明显提高色谱测试方法的开发效率。

      设计试验研究包括影响选择性的多个参数，例如固定相、pH值、有机改性剂，自动化运行极大加速了测试方法开发流程。

      合理审视数据后，完成最终测试方法经常是微调和优化如梯度坡度和温度等变量的过程。

      为了保证所开发的方法能够满足应用要求，需要使用前面确定的性能参数对方法进行验证。验证结果－使用Empower方法验证管理器对帕罗西汀方法的验证结果如下：

       高效液相色谱的使用？

高效液相色谱的使用？

      液相色谱仪是属于易学难用的仪器，比较讲究“正确使用”和经验。液相工作者接触最多的是流动相，流动相是造成液相色谱各种问题的关键源头。液相色谱仪常见的故障一是堵，二是漏。“堵”的表现现象就是柱压异常升高，直接原因就是流路不畅。堵塞的主要位置就是在色谱柱的前端，主要原因就是流动相里有杂质，杂质的主要来源就是细菌。

      注：流动相以甲醇为例，色谱柱以C18为例，液相色谱仪引起堵的原因如下：

      原因一：配制流动相时细菌污染

      首先我们要认识到，一般的国产甲醇其实不需要额外过滤处理，直接使用没有问题。即使是有些固态微粒杂质，也能在液相流路系统最前端的过滤头上排除，真正容易引起问题的，是水中的细菌。+U&&新制备的纯水在室内放置几天就会长菌，而这些细菌虽然肉眼不可见，却足以堵塞柱填料颗粒的空隙，造成柱子很快报废。这就是在配制流动相时造成的细菌污染的原因，解决它的方法很简单，就是确保水的可靠性。

      推荐两种解决方法：

      　　（1）理想的方式当然是购买实验室专用纯水机，既方便又可靠，质量也放心。

      　　（2）成箱购买市售品牌纯净水，如500ml一支的怡宝或娃哈哈，这些水的质量足以应付液相色谱的要求。先随机抽取一支做一下细菌平板实验，待菌落数合格方可使用。这样每次只要单独开一支即可，也很方便。每次成本2元左右。细节是：在绝大多数书本上，凡谈到配制流动相都会谈到后面有一个过滤的步骤。从我们长期使用的实际效果来说，只要能保证水的质量，这一步完全可以也应当去除。

      因为：

      （1）流动相过滤在理论上有好处，但是实际操作时由于不可能做到专瓶专用，反而容易造成的交叉污染，对于配比复杂的流动相影响更大。

      （2）流动相过滤在经济成本上不划算。买一套过滤装置要6000多元，且过滤器公认是比较容易损坏的设备。主要是过滤片的成本太高，一片就要几十元。按一般液相柱的正常使用寿命计算，过滤片的成本会远远高于色谱柱的成本。

      （3）流动相过滤对于工作效率成本不划算。使用溶剂过滤器有一个预清洗、装备、使用、用后清洗，晾干的过程，至少也有一个小时的时间。这个成本也不能忽视。

      （4）在实际工作未发现流动相不过滤会对柱寿命有任何影响。我们起码有6年时间没有做过流动相过滤的工作，但是和国内同行相比较，在同等使用强度下我们的柱寿命是比较长的。

      原因二：使用流动相时的细菌污染

      　　指的是：流动相刚开始没有长菌，在使用时却产生了细菌污染。主要是在使用多元液相色谱仪时的一种不良使用习惯造成的。

      举最简单的例子：50％的甲醇水流动相，有两种使用方式。

      一种方式是在上机前就配好混合在一起；

      另一种方式是在流路A放纯甲醇，流路B放纯水。

      从单纯实验效果来说，后一种有明显的优点：首先是简单，不需要实验者另个计算配比混合，其次就是比例准确，能得到保留时间重复性极好的实验效果。它有一个致命的缺陷就是纯水在流动相瓶中几天时间就会长细菌（很多情况下不仅仅用纯水作流动相，而是用缓冲盐溶液，本身就是优质肥料，细菌长得更迅速），一旦有细菌柱子就坏得很快。所以这种方式要求操作人员每次实验都要用新制备的纯水，更要求在每次实验后把水相换掉，换成甲醇冲洗干净，这一点在实际工作中很多人意识不强，就是意识到了但多次使用中总有一两次会遗漏，但是往往这一两次就足以产生致命的影响。因为液相色谱柱的堵塞是不可逆的。宁可牺牲小小的保留时间的重复性，也不要用纯水溶液作为流动相的一组。从实际实验效果来说，建议用10％的甲醇水代替纯水溶液（不同比例甲醇水的细菌总数实验：在5％就基本可以抑菌，在10％及以上就可以完全杀菌了），这样可以有效排除长细菌的隐患，既可作流动相，也可冲柱。

      原因三：不适当操作

      　　1）在更换零件时选择的型号有误，接口不是很匹配，在拧紧的时候产生变形而使得管路堵塞。

      　　2）样品处理液净化得不干净，长期会在六通阀和柱之间形成阻塞不畅。

      　　3）在使用手动六通阀时，有些人可能由于手劲小的原因，转动的不到位，于是造成流路形成了死堵，压力快速升高超过警戒值。

      　　4）在使用金属管路作出废液管时，应当注意最好废液瓶中先放一些水，并把废液管的出口端放在液面下。如果位于在液相上且实验使用较高浓度的缓冲盐溶液，在停机时可能在出口端结晶成块并造成堵塞。这种情况不常见，的确有发生过。

      　　查堵的方法：在发生“堵”的现象后，就需要找出原因，主要是什么位置发生了“堵”。注意，绝大多数情况下，整个系统只会有一个地方发生堵塞。查堵的方法是从尾向前逆向分段拆开，仔细观察压力数值，如果某一个部件（柱子除外）装上和拆下时的压力差别很大，可发展变化判断。至于柱的堵塞，可以通过换同样规格的柱的压力是否一致来判断。

高效液相色谱装流动相的瓶子近一年没用，脏，请问怎么处理，买硝酸泡吗，要多少浓度的、用什么容器？

      追溯液相色谱的发展历史，最早最经典的液相色谱实验当属俄国植物学家茨维特的叶绿色提取实验：将植物色素提取液从一根装有碳酸钙吸附剂的玻璃管顶端加入，然后用纯石油醚进行淋洗，随着石油醚往下流动，不同色素逐渐分开形成色带。液相色谱技术发展到今天，商业化的色谱仪已广泛用于分析混合物，但无论仪器设备怎样发展，现代色谱仪的组成仍源于茨维特实验。液相色谱仪主要包括储液瓶、泵、进样器、色谱柱、检测器、数据处理系统(图1)本专题将按色谱仪的基本组成，简要介绍各部分的工作原理及注意事项。

1.储液瓶

      储液瓶用于盛放流动相（图2），规格有25ml、500ml、1000ml、2000ml甚至更大。储液瓶通常为高硼硅玻璃材质，也有特殊情况，比如离子色谱使用聚氯乙烯储液瓶以避免引入金属离子干扰。存储特殊的流动相时，储液瓶的颜色也会不同。比如水相，常用棕色瓶进行避光，以降低细菌生长速度。

      开孔储液瓶瓶盖是与储液瓶配套使用的，流动相传输管穿过瓶盖上的孔插入储液瓶内。瓶盖主要包括三部分：聚丙烯外壳、硅胶防漏垫圈和四氟乙烯白色内盖，该类材质需具有良好的抗腐蚀、耐高温性能。瓶盖有单孔、双孔、三孔等规格，用于插入不同数目的管路（图2b），管路与孔之间存在一定间隙或有多余的孔用于排气，以防止瓶内负压过低，导致流动相不能顺畅输出到泵体。

      洁净度是储液瓶最基本也是最重要的标准。不干净的储液瓶会引入杂质，干扰分析结果，甚至将导致后续流动相管路堵塞，诱导泵体故障。因此，储液瓶需要定期按标准玻璃器皿清洗流程进行清洗，以确保流动相质量。主要过程如下：（1）浸酸：将储液瓶浸泡于重铬酸钾、浓硫酸、蒸馏水的清洁液中，时间不少于4小时。清洁液具有很强的氧化作用、去污能力强，能有效去除微生物和微量杂质；（2）冲洗：先用自来水充分冲洗，火吸管等冲洗10分钟，瓶内灌满、倒掉，反复20次以上；再用去离子水冲洗，不留死角，瓶内灌满、倒掉，反复10次以上，然后用超纯水进行充分漂洗和润洗，最后晾干或烘干备用。清洗液配比如下表：

      表1.不同酸度的重铬酸钾清洗液配比

      注意事项：清洗液使用耐酸抗氧化性塑料容器存储；将重铬酸钾倒入水中，搅拌溶解，然后缓慢加入浓硫酸，由于浓硫酸密度大，且遇水放出大量热，操作切勿过急，严禁将重铬酸钾溶液倒入浓硫酸中。

      上述清洗方法，需进行充分的冲洗和润洗，否则可能会引入较多杂质。笔者所在的色质谱实验室，流动相更换频率较高，在储液瓶中盛满有机相和超纯水的混合溶液（比如10%-20%有机相），超声半小时再进行超纯水清洗，可达到简单清洗的目的。储液瓶除定期清洗外，平时操作应养成良好习惯，比如：勤换水相；更换流动相，先润洗再更新，禁止在剩余流动相中直接添加新的流动相；瓶盖上多余不用的孔，可用堵头堵紧或用铝箔封住储液瓶口，防止灰尘落入。但是原则上不建议使用封口膜封住储液瓶口，因为流动相可能会溶出封口膜中的聚合物成分产生杂质。

2.过滤沉子

      过滤沉子位于流动相管路末端（图2a），在重力作用下使流动相管路没入储液瓶底部。沉子是表面具有1μm、2μm、5μm、10μm、20μm等各种孔径规格的吸滤头，常用规格为2μm和10μm，能有效防止已经进入储液瓶内的灰尘进入后续液相系统。储液瓶一般高于泵体50cm以上，基于虹吸作用，流动相能快速经过沉子。市场上基本的沉子有不锈钢、陶瓷、Peek等其他惰性材质(图2c)。

      过滤沉子也需定期进行超声清洗。用于反相色谱的沉子，先用超纯水加热超声15分钟以除去沉子上的盐分，再用HPLC级的异丙醇超声15分钟除去有机物，最后用HPLC级甲醇超声15分钟除去难溶物。用于正相色谱的沉子，超声使用的溶剂依次为乙醇-超纯水-异丙醇-乙醇，超声时间为15分钟左右。

3.流动相

      流动相是影响色谱分离的关键因素之一，高纯度、无微粒的流动相是液相色谱分析最重要的标准之一。满足这一标准，最简单的方式是尽可能使用高质量的溶剂，高效液相色谱纯（HPLC）级别是液相色谱的基本要求，对于液质联用仪器，由于质谱具有很高的灵敏度，要求使用质谱纯（LC-MS）级别的溶剂。

      3.1配制液相流动相可分有机相和水相，为保证流动相配比的准确性和质量，配制流动相时需注意以下事项：

      3.2过滤进口商业化的HPLC试剂在分瓶之前已经过滤膜过滤（一般为0.22μm），Milli-Q超纯水在纯化过程的最后一步，也会经过0.22μm滤膜。此类HPLC纯度的溶剂可以直接使用，无需再进行过滤。如果在上述流动相中添加其他非HPLC级别的试剂或者缓冲盐，使用前强烈建议过0.22μm滤膜。

      流动相过滤装置见图3，主要包括：滤杯，滤膜，砂芯，接收瓶，真空泵。流动相盛放于滤杯中，在真空用下，经滤膜和砂芯过滤，最后被接收瓶接收。过滤装置使用的玻璃器皿或连接管要求为惰性材质，避免引入更多杂质。滤膜常用孔径为0.22μm和0.45μm，根据流动相性质差异，滤膜又可分水相滤膜和有机相滤膜，以确保过滤过程中，滤膜成分不被流动相溶解带入更多杂质。

      3.3脱气商业化的液相色谱仪具有在线脱气功能，保证流动相进入泵前除去气泡。流动相中若含有气泡，会导致泵压增加，流动相传输不畅；对于检测器而言，气泡的存在会产生假的色谱信号，导致基线不稳；对于电化学检测器，气泡中氧气的存在，甚至导致化合物氧化、检测结果不准。因此流动相需要进行脱气处理。氦气喷雾脱气、真空脱气和在线脱气是常见的脱气方式。

      3.3.1氦气脱气氦气在流动相中溶解度小，可有效脱去流动相中的气泡。具体做法为：在流动相储液瓶中，插入一根氦气管路，没入流动相的一端连接过滤沉子，另一端连接低压力的氦气流（5psi左右），由于氦气难溶，在其逸出液面过程中将带走流动相中溶解的空气。需要提醒的是，不同体系，使用氦气脱气也稍有不同。反相色谱，使用该方法脱气数分钟可达到目标；而正相色谱，由于流动相极易挥发，需缩短脱气时间或通过其他方式脱气。常规的液相分析仪器，使用氦气脱气较少，在制备液相色谱中，由于管路粗，流动相流速大，流动相中易含有空气，氦气脱气较为普遍。色质谱实验室正反相制备色谱仪，均采用氦气补入进行脱气。

      3.3.2真空脱气流动相置于真空环境10-15分钟，可有效脱去流动相中60-70%的溶解气体。在图3中，流动相过滤结束，接收瓶用惰性橡皮塞封口，真空泵继续工作数分钟，即可实现流动相脱气。实验室中将整个流动相储液瓶放在超声波清洗仪中进行超声，也可脱气。

      3.3.3在线脱气在线脱气是最为普遍的一种脱气方式，商业化的液相设备都装有在线脱气机，位于高压混合器或者比例阀之前（图4a）。在线脱气机的工作原理如图4b所示：流动相经过聚合物管路，该管路能选择性让气泡通过，而流动相不通过，整个管路置于真空腔体中，由于压力变化，溶解在流动相中的气泡将被拉出聚合物管道。与氦气脱气相比，在线脱气效率较低，但成本较低。

高效液相色谱装流动相的瓶子近一年没用，脏，请问怎么处理，买硝酸泡吗，要多少浓度的、用什么容器？

      刷洗干净，烘干，铬酸洗液浸泡一天，洗净，烘干。